ТЕХНОЛОГИИ
Библиотеки фагового дисплея антител, матурация и инженеринг антител
Библиотеки фагового дисплея антител, матурация и инженеринг антител
Антерикс владеет и постоянно усивершенствует банк библиотек антител, представленных на поверхности филаментного фага М13. Эти библиотеки имеют суммарный репертуар, т.е. количество разнообразных анинокислотных сиквенсов, значит и форм антител, свыше 1012 структур. Это разнообразие превышает средний репертуар структур иммуноглобулинов человека или животных в тысячи раз. Наши антительные библиотеки являются уникальными для России, успешно использованы в ближе к сотне антительных проектов, как внутренних, так и для партнеров. На практике, у нас не было еще ни одной программы, когда мы не были бы способны индетифицировать специфичное антитело или набор антител для новой мишени.
В зависимости от задачи, в программах мы используем различные библиотеки. Для терапевтических програм, обычно, лекарственные антительные кандидаты селектируются из наших 8 человеческих антительных библиотек, сконструированных как scFv, так и в Fab форматах. Гуманизированные антитела, тоже пригодные для терапевтических программ селектируются из фокусированных библиотек фагового дисплея, сконструированных для каждой мишени/прораммы индивидуально. Для этого мышей или лам предварительно иммуницируют антигеном-мишенью, после чего из животных с максимальным титром выделяются В клетки, обратной транскрипцией идентифицируются библиотеки вариабельных доменов иммуноглобулинов, и конструируются фокусированные библиотеки антител. Далее, селекция мишень-специфичных антител проводится как и выше, для нивных библиотек.
В зависимости от задачи, в программах мы используем различные библиотеки. Для терапевтических програм, обычно, лекарственные антительные кандидаты селектируются из наших 8 человеческих антительных библиотек, сконструированных как scFv, так и в Fab форматах. Гуманизированные антитела, тоже пригодные для терапевтических программ селектируются из фокусированных библиотек фагового дисплея, сконструированных для каждой мишени/прораммы индивидуально. Для этого мышей или лам предварительно иммуницируют антигеном-мишенью, после чего из животных с максимальным титром выделяются В клетки, обратной транскрипцией идентифицируются библиотеки вариабельных доменов иммуноглобулинов, и конструируются фокусированные библиотеки антител. Далее, селекция мишень-специфичных антител проводится как и выше, для нивных библиотек.
Наши человеческие наивные библиотеки созданы на основе синтетического гена антитела, широко представленного в человеке, поэтому минимально иммуногенны, и, помимо этого, обладают высоким потенциалом взаимодействия с различными антигенами, а также улучшенными физико-химическим характеристиками, важными при создании лекарственной формы. Синтетическая кодоноптимизированная версия используемых генов на основе VH -DP47 (variable heavy chain/вариабельный домен тяжелой цепи) и VL – DPK22 (variable light chain/вариабельный домен легкой цепи) имеет ряд преимуществ над донорскими библиотеками: лучшие, в среднем, термодинамические характеристики этих доменов, оптимальный дизайн гена для экспрессии белка как в бактериальной, так и в эукариотической системах, технологичный дизайн для матурационного процесса на стадии in vitro, улучшенные свойства.
Репертуар каждой наивной библиотеки в scFv, или -Fab формате, составляет около ста миллиардов (1011) структурных вариантов. Как было описано ранее, чем выше разнообразие, тем больше вероятность получения первичных кандидатов антител с высокой аффинностью, специфичностью и эпитопным разнообразием, обуславливающим создание антител как агонистов, так и антагонистов различных рецепторов, сложных мембранных белков, типа GPCR, или водорастворимых мишеней.
Далее после отбора первичных кандидатов решается задача изменений их характеристик: аффиности, специфичности и, как отмечено выше, термостабильности, агрегационного поведения. Этот ступенчатый процесс улучшения и инженеринг антител называется Матурацией антител.
В конечном счете вариабельные домены индетифицироиванных антител конвертируются с помощью генной инюенерии в полноформатные иммуноглобулины необходимого формата (обычно IgG1, IgG2, или IgG4) и требуемой структурой Fc домена, напромер с усиленной или ослабленной ADCC, CDC, улучшенной афинностью для неонатального рецептора Fc (FcRn) для увеличения циркулации антитела (half-life) in vivo.
Антитела для диагностических, реагентных или других целей обычно селектируются из фокусированных библиотек, полученнных из пре-преиммунизированных кроликов, мышей или же уток (по той же вышеописанной схеме), где общие характеристики получаемых антител более подходят для поставленных диагностических и реагентных, а не терапевтических задач.
Репертуар каждой наивной библиотеки в scFv, или -Fab формате, составляет около ста миллиардов (1011) структурных вариантов. Как было описано ранее, чем выше разнообразие, тем больше вероятность получения первичных кандидатов антител с высокой аффинностью, специфичностью и эпитопным разнообразием, обуславливающим создание антител как агонистов, так и антагонистов различных рецепторов, сложных мембранных белков, типа GPCR, или водорастворимых мишеней.
Далее после отбора первичных кандидатов решается задача изменений их характеристик: аффиности, специфичности и, как отмечено выше, термостабильности, агрегационного поведения. Этот ступенчатый процесс улучшения и инженеринг антител называется Матурацией антител.
В конечном счете вариабельные домены индетифицироиванных антител конвертируются с помощью генной инюенерии в полноформатные иммуноглобулины необходимого формата (обычно IgG1, IgG2, или IgG4) и требуемой структурой Fc домена, напромер с усиленной или ослабленной ADCC, CDC, улучшенной афинностью для неонатального рецептора Fc (FcRn) для увеличения циркулации антитела (half-life) in vivo.
Антитела для диагностических, реагентных или других целей обычно селектируются из фокусированных библиотек, полученнных из пре-преиммунизированных кроликов, мышей или же уток (по той же вышеописанной схеме), где общие характеристики получаемых антител более подходят для поставленных диагностических и реагентных, а не терапевтических задач.
Экспрессионная система pANTHER и разработка суперпродуцентов
Экспресионная система (ЭС) pANTHER, созданная и используемая Антериксом вместе с партнером, позволяет в короткие сроки создавать стабильные клонированные линии клеток-суперпродуцентов CHO с продуктивностью в несколько граммов/литр культуры. ЭС доступна для лицензии. Антерикс также выполняет работы по созданию Master Cell Line для партнеров.
Стабильные клонированные линии клеток называемые Master Cell Line (MSL) или Research Cell Bank (RCB), в сущности, являются мини-фабриками по прозиводству моноклональных антител или других рекомбинантных белков. Так как весь целевой белок прозиводится из размноженной (клональной) одной клетки, то и свойста полученного моноклонального антитела или другого белка строго идентичны на молекулярном уровне.
Для создания RCB важно иметь два подходящих инструмента: специальная экспрессионная система (ЭC) и специально разрабитанные для этой цели линии клеток, чаще всего суспенционная клонироиванная линия клеток CHO (Chinese Hamster Ovary cell line), и реже, NS0.
Генерация RCB начинается с конструиривания специальных ехпрессионных векторов, где ген белка, а в случае моноклонакльных антител - два гена, интегрируются в ЭС, сиквенируются и ДНК производится для дальнейшей трансфекции CHO. После получения стабильного пула клеток, экспрессирующих моноклональное антитело, пул клеток делится на сотни и тысячи отдельных одиночных клеток, которые размножаются и проверяются на продуктивность и качство белка. Лучшие клоны-кандидаты снова клонируются в процессе, называемом субклонированием.
Большое мноюжество клонов, полученных после субклонирования снова скринируются на основные важные параметры, включая продуктивность, скорость деления, качество белка и посттрансляционного процессинга, и многие многие другие параметры. Лучшие клоны-продуценты проверяются на сохранение стабильно высокой экспрессии после 60-ти генераций. Кроме того, нами проводится обширная биоаналитика полученного антитека на биоподобность, если данное антитело является биосимиляром, в ряде биохимических и биофицических анализов.
Нами также разрабатываются и проводятся основные клеточные функциональные био-анализы для подтверждения биологической активности, демонстрации эквиовалентности полученного антитела-биосимиляра его первичному оригиналу, используемому во всех основных анализах как контроль. Полученные нами RCB обычно прозиводят граммовые количества целевого антитела на один литр среды.
Для создания RCB важно иметь два подходящих инструмента: специальная экспрессионная система (ЭC) и специально разрабитанные для этой цели линии клеток, чаще всего суспенционная клонироиванная линия клеток CHO (Chinese Hamster Ovary cell line), и реже, NS0.
Генерация RCB начинается с конструиривания специальных ехпрессионных векторов, где ген белка, а в случае моноклонакльных антител - два гена, интегрируются в ЭС, сиквенируются и ДНК производится для дальнейшей трансфекции CHO. После получения стабильного пула клеток, экспрессирующих моноклональное антитело, пул клеток делится на сотни и тысячи отдельных одиночных клеток, которые размножаются и проверяются на продуктивность и качство белка. Лучшие клоны-кандидаты снова клонируются в процессе, называемом субклонированием.
Большое мноюжество клонов, полученных после субклонирования снова скринируются на основные важные параметры, включая продуктивность, скорость деления, качество белка и посттрансляционного процессинга, и многие многие другие параметры. Лучшие клоны-продуценты проверяются на сохранение стабильно высокой экспрессии после 60-ти генераций. Кроме того, нами проводится обширная биоаналитика полученного антитека на биоподобность, если данное антитело является биосимиляром, в ряде биохимических и биофицических анализов.
Нами также разрабатываются и проводятся основные клеточные функциональные био-анализы для подтверждения биологической активности, демонстрации эквиовалентности полученного антитела-биосимиляра его первичному оригиналу, используемому во всех основных анализах как контроль. Полученные нами RCB обычно прозиводят граммовые количества целевого антитела на один литр среды.
Технология парамагнитных протеколипосом
Технология парамагнитных протеколипосом
Для успешной селекции человеческих моноклональных антител против сложных мембранных белков (GPCRs, ионные каналы, транспортеры) нами разработана технология презентации таких белков-мишеней на поверхности парамагнитных протеолипосом (ПМПЛ). Очищенный, высококонцентрированный белок-мишень представляется на поверхности ПМПЛ в нативной и правильно ориентированной конформации, после чего липидная мембрана восстанавливается для стабилизации мембранных белков. Для получения таких ПМПЛ мы сперва разрабатываем стабильные культуры клеток млекопитающих, экспрессирующих целевую мембранную мишень (включая его человеческий, обезьяньий и мышиный ортологи) на уровне 5х105 – 106 молекул на клетку. После получения ПМПЛ дальнейшая идентификация антител-терапевтических кандидатов проводится их селекцией из наивных библиотек фагового дисплея человеческих антител, или же из фокусированных библиотек фагового дисплея, полученных из пре-иммунизированных ПМПЛ животных (ламы или других животных).
ПМПЛ проявляют себя как очень эффективные иммуногены для дальнейшего получения эффективных фокусированных библиотек. Кроме того, ПМПЛ были успешно использованы в более десяти программах по селекции антител из наивных и фокусированных библиотек, а также в матурации антител.
ПМПЛ проявляют себя как очень эффективные иммуногены для дальнейшего получения эффективных фокусированных библиотек. Кроме того, ПМПЛ были успешно использованы в более десяти программах по селекции антител из наивных и фокусированных библиотек, а также в матурации антител.
Адрес:
Россия, Московская область,
г. Пущино, ул. Институтская, д.7
Россия, Московская область,
г. Пущино, ул. Институтская, д.7
ANTHERIX
ANTHERIX
терапевтические антитела
терапевтические антитела
Контакты:
Телефон: +7 (965) 261 10 41
Электронная почта: info@antherix.ru
Телефон: +7 (965) 261 10 41
Электронная почта: info@antherix.ru
